Хроматография – метод разделения и анализа сложных молекулярных соединений и их смесей, основанный на принципе сорбции. Анализируемое вещество распределяется между двумя фазами – подвижной (жидкий или газообразный элюент) и неподвижной (жидкий или твердый сорбент). Различные компоненты смеси по-разному взаимодействуют с адсорбентами, позволяя сделать точные выводы о количественном и качественном составе смеси.
Впервые метод был описан в 1903 году Михаилом Цветом для разделения растительных пигментов. Впоследствии методика совершенствовалась многими учеными, и сегодня активно используется для исследования полезных ископаемых, в установках по определению качества и опреснения воды, на фармакологических, химических и пищевых производствах. Широкое распространение хроматография получила в медицине, где она применяется для диагностики заболеваний за счет обнаружения различных биохимических маркеров в физиологических жидкостях. В этой статье мы рассмотрим основные медицинские и фармакологические задачи, которые помогает решить хроматографическое оборудование.
- Классификация видов хроматографии
- Применение газовой хроматографии в медицине
- Жидкостная хроматография в медицине
- Перспективы применения
Классификация видов хроматографии
Особенности хроматографического процесса зависят от того, какой вид методики используется в конкретном случае. Метод классифицируется по свойствам элюента, способу перемещения сорбатов и некоторым другим характеристикам. Рассмотрим наиболее популярные классификации.
По физической природе
По физической природе подвижной и неподвижной фаз выделяют следующие виды хроматографии:
- жидкостную – в качестве подвижной фазы используется жидкий растворитель;
- газовую – носителем анализируемого вещества выступает газ.
При этом жидкостная хроматография подразделяется на твёрдо-жидкофазную и жидко-жидкофазную, а газовая – на газоадсорбционную, газожидкостную и газораспределительную. В медицине используются все вышеперечисленные виды. К примеру, с помощью жидкостных исследований можно обнаружить свободные аминокислоты в крови и лимфе, а с помощью газовых – определить концентрацию токсинов в тканях пациента.
По технике выполнения
По технике выполнения методики подразделяются на:
- колоночную – неподвижная фаза помещается в колонку;
- плоскостную (бумажную и тонкослойную) – разделение происходит на поверхности специальной бумаги или тонком слое сорбента, нанесенном на пластинку;
- капиллярную – смесь разделяется на плёнке жидкости или поверхности сорбента в трубке.
В отдельную категорию выделают так называемую хроматографию в полях, в ходе которой разделение вещества происходит под действием магнитного поля, центробежной силы или других физических сил.
По способу перемещения разделяемой среды
Ещё одна классификация описывает хроматографическую методику по способу перемещения разделяемой среды вдоль сорбента:
- Элюентная или проявительная. Подготовленная проба вводится в колонку, перемещается в элюенте и разделяется на адсорбенте. Разная скорость сорбции обуславливает разную скорость выхода отдельных компонентов смеси из колонки.
- Фронтальная. Проба подается на сорбент постоянным потоком, то есть по сути является подвижной фазой.
- Вытеснительная. Методика аналогична проявительной, но при этом элюент не применяется. Часть веществ лучше взаимодействует с твердой фазой, за счет чего вытесняются соединения, менее склонные к сорбции. В результате смесь делится на составляющие.
Отдельно выделяют электрохроматографию, в которой движение соединений происходит за счет приложения направляющих сил (электрического тока). В медицине наиболее оправдано применение проявительной (элюентной) методики, поскольку она позволяет получить точные данные о составе многокомпонентного соединения.
Применение газовой хроматографии в медицине
На протяжении долгого времени эта методика применялась в медицине с некоторыми ограничениями. Ученые объясняли это тем, что биологические жидкости не обладают необходимой летучестью и мало устойчивы к физико-химическим воздействиям, из-за чего сложно получить точный результат. Но с совершенствованием газохроматографической методики и хроматографов, это ограничение удалось преодолеть.
Сегодня с ее помощью определяют:
- Концентрацию различных биологических маркеров в крови, лимфе, слюне;
- Степень очистки и качество выпускаемых лекарственных препаратов;
- Метаболизм различных биологически активных веществ в теле пациента.
Подробнее рассмотрим наиболее распространенные примеры применения методики в медицине.
Анализ жирных кислот
Для идентификации штамма патогенных микроорганизмов используется метод посева, при котором образец помещают в питательную среду и ждут развития колонии бактерий. Минус такого анализа заключается в его длительности: требуется не менее двух суток, чтобы точно определить вид патогена.
Газовая хроматография позволяет определить возбудителя по жирным кислотам, содержащимся в микробных клетках и их метаболитах. Липидные соединения в мембранах бактерий специфичны. Благодаря этому данный метод можно применять для ускоренной идентификации штамма микроорганизмов.
Пиролиз микроорганизмов
Ещё один способ, позволяющий точно установить вид бактерий, – это изучение газообразных продуктов пиролиза (термического разложения). При нагреве микроорганизмов выделяется смесь газов, которая уникальна для каждого штамма. Этот метод дает возможность исследовать образующиеся соединения и в результате идентифицировать микробы.
Экстракция компонентов микробных клеток
Компоненты клеточных структур и мембран различных микроорганизмов уникальны. С помощью газохроматографического исследования можно не только выявить патоген, но и поставить диагноз.
Наиболее показательными являются липиды, углеводы и жирные кислоты, содержащиеся в микробных клетках. В практической медицине они исследуются для:
- ускоренной постановки диагноза «газовая гангрена»;
- обнаружения метаболических нарушений в теле пациента;
- контроля над эффективностью лечения дисбактериоза и других заболеваний желудочно-кишечного тракта;
- диагностики пероксисомных нарушений;
- контроля над состоянием диабетиков и лиц, получивших сильные ожоги.
В исследовательской медицине такой анализ применяется для более глубокого понимания метаболических процессов, протекающих в клетках живых организмов. Например, с помощью этого метода был детально изучен атеросклероз и выработаны наиболее эффективные схемы его лечения и профилактики.
Определение лекарственных и наркотических средств
Хроматографический анализ используется также для обнаружения некоторых лекарственных и наркотических препаратов, например, барбитуратов. Для определения этой группы седативных средств применяется несколько методик. К примеру, можно использовать готовые формы медикаментов либо предварительно получать их производные. Выбор метода зависит от конкретной цели лабораторного сотрудника и имеющегося у него оборудования.
Чаще всего для определения барбитуратов в физиологических жидкостях человека выбирается газохроматографическая колоночная методика, но также может применяться высокоэффективная жидкостная хроматография.
Ещё один класс препаратов, определяемых с помощью хроматографов, — трициклические антидепрессанты. Их назначают при лечении психических расстройств и депрессий. Изучение концентрации данных веществ в крови пациентов позволяет скорректировать медикаментозную терапию и оценить ее эффективность.
Применение хроматографов оправдано и для обнаружения следующих средств:
- антиконсульванты;
- бензодиазепины;
- противоопухолевые препараты.
В отдельную категорию исследований выделяют обнаружение наркотиков в образцах мочи. Хроматографические методики используются для скрининга в физиологических жидкостях наркотических препаратов, что является неотъемлемой частью программы по профилактике и лечению наркомании в стране.
К преимуществам метода относится:
- высокая скорость получения результата;
- возможность обнаружения биологических маркеров и лекарственных препаратов в микроскопических концентрациях;
Жидкостная хроматография в медицине
При проведении медико-биологических исследований применяется не только газовая, но и жидкостная хроматография. Наиболее часто используются следующие ее разновидности:
- Аффинная. Метод, эффективный для обнаружения ферментов и вирусов. В качестве сорбента обычно используется гелеобразное вещество наподобие агарозы. Пробу с анализируемым составом пропускают через колонку с сорбентом, который удерживает и концентрирует фермент. Разделение по аффинной методике основано на специфических взаимодействиях: между ферментом и ингибитором, гормоном и рецептором и так далее. Уникальность метода заключается ещё и в том, что он позволяет выявлять целые клетки.
- Эксклюзионная. Метод основан на способности молекул разного размера заполнять собой поры геля. Анализируемое вещество вместе с подвижной фазой движется вдоль сорбента внутри колонки. Небольшие молекулы постепенно заполняют сорбент, тогда как крупные выходят вместе с элюентом. Применение эксклюзионного хроматографического метода в медицине и биологии оправдано для фракционирования вирусов и субклеточных частиц, очистки белков, и при контроле над радиоактивными метками.
- Ионообменная. Методика основана на различной способности ионов к ионному обмену. Некоторые частицы удерживаются на неподвижной фазе за счет возникающих электростатических сил, другие остаются в элюенте, за счет чего и происходит разделение многокомпонентной смеси. Ионообменный метод применяется для анализа нуклеиновых кислот, обнаружения радиоизотопов, токсинов в физиологических жидкостях.
- Тонкослойная. Основывается на многократном пересечении молекулами пробы границ между подвижной и неподвижной фазами, в результате чего и происходит разделение. Долгое время тонкослойный метод был наиболее часто применяемым в медицине для исследования структуры белков и нуклеиновых кислот. Сейчас он также широко используется благодаря простоте и дешевизне.
Точность хроматографического анализа во многом определяется правильным выбором подвижной и неподвижной фаз, тщательной подготовкой пробы, настройками и возможностями самого оборудования. Поэтому так важно, чтобы исследование проводили опытные специалисты на современных хроматографах.
Перспективы применения
Постоянное совершенствование хроматографических методик позволяет утверждать, что применение газовых хроматографов в медицине станет ещё более востребованным в ближайшие годы. Данный метод незаменим для обнаружения и анализа метаболических сред (крови, лимфы, мочи, выдыхаемого воздуха). Хроматограф позволяет полностью изучить состав каждой такой биологической среды и обнаружить в ней вирусы, бактерии, продукты распада наркотических или лекарственных препаратов, следы ядов.
Однако хроматографический анализ в медицине необходим не только для диагностики заболеваний. Он также позволяет контролировать ход лечения, выявлять реакцию пациента на введенные медикаменты и корректировать терапию, исходя из полученных данных. Если вы хотите больше узнать о возможностях современных газовых хроматографов, то свяжитесь со специалистами компании «Мета-хром» по контактному телефону, указанному на сайте.
